Vigtigste
Bronkitis

Rekombinant interferon

LÆGEMIDLER MED RECEPTIVE FERIE ER KUN TILSTILLET AF PATIENTEN KUN DOKTOREN. DENNE INSTRUKTION KUN FOR MEDARBEJDERE.

Beskrivelse af det aktive stof Interferon alfa-2b human rekombinant / interferonum alfa-2b.

Formel, kemisk navn: ingen data.
Farmakologisk gruppe: immunotropiske lægemidler / immunomodulatorer / interferoner; antitumormidler / andre antitumormidler; antimikrobielle, antiparasitiske og antihelminthiske / antivirale midler / antivirale (undtagen HIV-midler).
Farmakologisk virkning: immunmodulerende, antitumor, antiviral, antiproliferativ.

Farmakologiske egenskaber

Lægemidlet syntetiseres af bakterieceller af Escherichia coli stamme SG-20050 / pIF16, i det genetiske apparat, hvortil humant interferon alfa-2b genet er indsat. Lægemidlet er et protein, som indeholder 165 aminosyrer, det er identisk i egenskaber og egenskaber ved human leukocytinterferon alfa-2b. Antiviral effekt manifesteres under reproduktionen af ​​virussen, der er en aktiv inklusion af lægemidlet i cellernes metaboliske processer. Reagerer med specifikke receptorer på celleoverfladen initierer lægemidlet en række intracellulære ændringer, herunder produktion af specifikke enzymer (proteinkinaser og 2-5-adenylatsyntetase) og cytokiner, som nedsætter syntesen af ​​ribonukleinsyre af viruset i cellen og viralproteinet. Forøger den fagocytiske aktivitet af makrofager, forbedrer den specifikke cytotoksiske virkning af lymfocytter på målceller. Ændringer i den funktionelle aktivitet af immunkompetente celler, den kvalitative og kvantitative sammensætning af cytokinerne, der udskilles, dannelsen og udskillelsen af ​​intracellulære proteiner. Undertrykker proliferationen af ​​tumorceller og dannelsen af ​​visse onkogener, som hæmmer tumorvækst.
Maksimal koncentration af lægemidlet, når det administreres parenteralt, opnås i 2 til 4 timer. Efter 20-24 timer efter administration af lægemidlet i blodplasmaet er ikke defineret. Koncentrationen af ​​lægemidlet i serum afhænger direkte af hyppigheden og dosen. Det metaboliseres i leveren, udskilles hovedsageligt gennem nyrerne, delvist uændret.

vidnesbyrd

Terapi og forebyggelse af influenza og akutte respiratoriske virusinfektioner; nødforebyggelse af krydsbåren encephalitis med tykbåren immunoglobulin; atopiske sygdomme, allergisk rhinoconjunctivitis, bronchial astma under specifik immunterapi.
Omfattende behandling hos voksne: akut viral hepatitis B (moderate og svære former i begyndelsen af ​​isterioden indtil den femte dag med gulsot (i senere perioder er lægemidlet mindre effektivt, med kolestatisk sygdom og udvikling af hepatisk koma, er lægemidlet ikke effektivt): akut langvarig hepatitis B og C, kronisk aktiv hepatitis B og C, kronisk hepatitis B med delta-agent, hårcelledukæmi, nyrekræftstadie IV, maligne hudlymfomer (primær retikulose, svampe-mycosis, reticulom sarkomatose), basalcelle og skævt carcinom
Omfattende behandling hos børn fra 1 år: larynx respiratorisk papillomatose, startende fra dagen efter fjernelse af papillomer; akut lymfoblastisk leukæmi i eftergivelsesperioden efter ophør af induktionskemoterapi (4-5 måneders remission).

Metoden til anvendelse af human rekombinant interferon alfa-2b og dosis

Human rekombinant interferon alfa-2b injiceres intramuskulært subkutant i læsionen, subkonjunktivt indtaget, anvendt topisk. Dosering, dosis, tilstand og varighed af behandlingen indstilles individuelt afhængigt af beviset, alder, tilstand af patienten, tolerance af lægemidlet.
Under behandlingen skal generelle kliniske blodprøver udføres hver anden uge, biokemisk - hver 4. uge. Hvis det absolutte neutrofiltal er mindre end 0,50 X 10 ^ 9 / l, og blodpladeantalet er mindre end 25 X 10 ^ 9 / l, skal terapien afbrydes. Hvis det absolutte neutrofiltal er mindre end 0,75 X 10 ^ 9 / l, og blodpladetællingen er mindre end 50 X 10 ^ 9 / l, anbefales det at reducere dosis af lægemidlet midlertidigt med 2 gange og gentag analysen efter 1 - 2 uger; hvis ændringer opretholdes, anbefales det at annullere behandlingen.
Patienten skal overvåges nøje for tegn på nedsat leverfunktion. Brug af lægemidlet bør seponeres med symptomudviklingen.
Ved udvikling af overfølsomhedsreaktioner (angioødem, urticaria, anafylaksi, bronchospasme) afbrydes lægemidlet, og en passende lægemiddelbehandling er straks ordineret.
Det er nødvendigt at omhyggeligt overvåge nyrernes funktionelle tilstand i nærvær af mild og moderat nyreinsufficiens.
Ved langvarig brug af stoffet kan der udvikles lungebetændelse og pneumonitis. Aflastningen af ​​lægemidlet og administrationen af ​​glukokortikosteroider bidrager til lindring af lungesyndrom.
Når ændringer sker på den del af centralnervesystemet og / eller psyken, herunder depression, er det nødvendigt at observere en psykiater under behandlingen og inden for seks måneder efter færdiggørelsen. Efter behandlingens ophør er disse lidelser normalt hurtigt reversible, men nogle gange tager det op til 3 uger for dem at udvikle sig fuldt ud. Det anbefales at konsultere en psykiater og afbryde lægemiddelbehandling, hvis aggressiv adfærd rettet mod andre mennesker eller selvmordstanker optræder, symptomerne på psykiske lidelser forværres eller ikke forringes. Selvmordstanker og forsøg er mere almindelige hos børn i barndommen og i ungdommen end hos voksne. Hvis behandling med brug af lægemidlet er anerkendt som nødvendigt hos voksne patienter med alvorlige psykiske lidelser (herunder i historien), bør det kun startes, hvis behandling af psykiske lidelser og passende individuel screening udføres. Brug af lægemidlet hos patienter under 18 år med alvorlige psykiske lidelser (herunder en historie) er kontraindiceret.
Hos patienter med skjoldbruskkirtelpatiologi før behandling er det nødvendigt at bestemme niveauet af skjoldbruskkirtelstimulerende hormon, i fremtiden skal indholdet heraf overvåges mindst 1 gang om 6 måneder, samt når tegn på skjoldbruskkirtelsvigt forekommer. Brug af lægemidlet hos disse patienter bør være under kontrol af en endokrinolog. Ved udseende af nedsat thyreoideafunktion eller forværring af de eksisterende sygdomme, der ikke kan behandles, er det nødvendigt at stoppe medikamentet.
Ved langvarig brug af stoffet kan mulige krænkelser af synsorganet. Det anbefales at udføre en oftalmologisk undersøgelse inden behandlingens start. For eventuelle klager fra synsorganet er det nødvendigt med øjeblikkelig konsultation med en øjenlæge. Patienter med sygdomme, hvor der kan forekomme ændringer i nethinden (arteriel hypertension, diabetes og andre) skal gennemgå en oftalmologisk undersøgelse mindst en gang hvert halve år. I tilfælde af forværring eller udseende af synsforstyrrelser skal overveje at trække behandlingen tilbage.
Patienter med avanceret cancer og / eller patologi i det kardiovaskulære system skal have nøje overvågning og kontrol af elektrokardiogrammet. Når arteriel hypotension opstår, skal der gives passende behandling og tilstrækkelig hydrering.
Ældre patienter, der modtager lægemidlet i høje doser, kan have koma, nedsat bevidsthed, encefalopati, anfald. Med udviklingen af ​​disse lidelser og ineffektiv dosisreduktion, afbrydes behandlingen.
Ved langvarig brug af lægemidlet hos nogle patienter kan der forekomme antistoffer mod interferon. Typisk er antistoftitere lave, deres udseende reducerer ikke effektiviteten af ​​behandlingen.
I transplantationspatienter kan lægemiddelimmunosuppression være mindre effektiv, fordi interferon stimulerer immunsystemet.
Forsigtighed er ordineret til patienter med en tilbøjelighed til autoimmune sygdomme. Ved udvikling af symptomer på en autoimmun sygdom er det nødvendigt at foretage en grundig undersøgelse og vurdere muligheden for fortsat behandling med interferon. Nogle gange er medicinsk behandling forbundet med forværring eller forekomsten af ​​psoriasis, sarcoidose.
Under behandlingen skal man tage sig af, når man engagerer sig i potentielt farlige aktiviteter, der kræver øget opmærksomhed og hastighed af psykomotoriske reaktioner (herunder kørsel), og ved udvikling af træthed, døsighed, desorientering eller andre bivirkninger er det nødvendigt at opgive sådanne aktiviteter.

Kontraindikationer

Hypersensitivitet, alvorlige sygdomme i det kardiovaskulære system (nyligt myokardieinfarkt, hjertesvigt dekompensation trin, udtrykt hjertearytmi), alvorlige allergiske sygdomme, stærkt nedsat og / eller nyresvigt, autoimmun hepatitis, kronisk hepatitis med dekompenseret cirrose, sindssygdom og lidelser hos børn og unge, epilepsi og andre dysfunktioner i centralnervesystemet, autoimmune sygdomme i historien, zovanie immunsuppressive lægemidler efter transplantation, patologien af ​​skjoldbruskkirtlen, som ikke kan kontrolleres ved konventionelle terapier; graviditet, amningstid, brug hos mænd, hvis partnere er gravide.

Begrænsninger i brugen af

Svær myelosuppression, lever- og / eller nyresvigt, skjoldbruskkirtel sygdom, psoriasis, sarcoidosis, kronisk obstruktiv lungesygdom, diabetes, ketoacidose tilbøjelighed til, koagulationsforstyrrelser, psykiatriske lidelser, især fører til depression, selvmordstanker og forsøg historie.

Brug under graviditet og amning

Brug af lægemidlet er kontraindiceret under graviditet og amning.

Bivirkninger af human rekombinant interferon alfa-2b

Kardiovaskulær system og blod: forbigående reversibel kardiomyopati, arytmier, arteriel hypotension, myokardieinfarkt, leukopeni, lymfopeni, trombocytopeni, anæmi.
Fordøjelsessystem: tør mund, mavesmerter, kvalme, dyspepsi, vægttab, appetitløshed, diarré, opkastning, pancreatitis, hepatotoksicitet, forøget alaninaminotransferaseaktivitet, alkalisk phosphatase.
Nervesystemet og sanseorganer: irritabilitet, depression, nervøsitet, træthed, angst, søvnløshed, nedsat koncentrationsevne, aggressivitet, selvmordstanker, neuropati, psykose, nedsat hørelse, conjunctiva af den nedre kuppel hævelse, rødme og isolerede follikler af slimhinderne i øjet, fokal ændringer i fundus, nedsat synsstyrke, optisk neuritis, retinal blødning, retinal arteriel og venøs trombose, optisk nerveødem.
Hud: øget svedtendens, udslæt, kløe, hårtab, lokal inflammatorisk reaktion.
Endokrine system: ændringer i skjoldbruskkirtlen, diabetes mellitus.
Muskuloskeletale system: rhabdomyolyse, rygsmerter, benkramper, myosit, myalgi.
Åndedrætssystem: Faryngitis, dyspnø, hoste, lungebetændelse.
Urinsystem: Nyresvigt, der øger koncentrationen af ​​kreatinin, urinstof.
Immunsystemet: autoimmun patologi (rheumatoid arthritis, vaskulitis, lupus-lignende syndrom), sarcoidose, anafylaksi, angioødem, allergisk ødem, hævelse af ansigtet.
Andet: influenzalignende syndrom (feber, kulderystelser, asteni, træthed, træthed, artralgi, myalgi, hovedpine).

Samspillet mellem interferon alfa-2b human rekombinant med andre stoffer

Lægemidlet reducerer clearance og 2 gange øger koncentrationen af ​​aminophyllin i plasma.
Når det kombineres med amphotericin B, øges risikoen for nyreskade, hypotension, bronchospasme; med busulfan - veno-okklusiv leversygdom; med dacarbazin - hepatotoksicitet med zidovudin - neutropeni.
Lægemidlet forbedrer doxorubicinens toksicitet.
Når det kombineres med levothyroxin, ændrer natrium effekten, dosisjustering kan være påkrævet.
Ved anvendelse sammen med pegaspargas øges risikoen for bivirkninger.
Lægemidlet kan reducere aktiviteten af ​​cytochrom P-450 isoenzymer og påvirker derved metabolisme af phenytoin, cimetidin, chimes, diazepam, warfarin, theophyllin, propranolol, nogle cytostatika.
Kan forbedre myelotoksiske, neurotoksiske, kardiotoksiske virkninger af lægemidler, der tidligere eller i fællesskab blev indgivet.
Undgå samtidig brug med lægemidler, der hæmmer centralnervesystemet, immunosuppressive midler (herunder glukokortikosteroider).
Alkoholindtagelse anbefales ikke under behandlingen.
Når det anvendes sammen, kan hydroxyurea øge forekomsten af ​​kutan vaskulitis.
Når det kombineres med theophyllin, er det nødvendigt at kontrollere koncentrationen af ​​theophyllin i blodplasmaet og om nødvendigt justere doseringsregimen.

overdosis

I tilfælde af overdosering af lægemidler øges bivirkningerne. Afskaffelsen af ​​lægemidlet, der udfører symptomatisk og støttende behandling.

Handelsnavne af lægemidler med det aktive stof interferon alfa-2b human rekombinant

Kombinationslægemidler:
Interferon alfa-2b human rekombinant + Diphenhydramin: Ophthalmoferon®.

FarmGruppa:

Feedback og kommentarer

GMO - der er GMO, med hele sin

Petr Sun, 10/25/2015 - 21:40

GMO - er GMO med alle dens konsekvenser.

fast sidevask: sved

Natalia Su, 12/13/2015 - 13:00

faste bivirkninger: svedende kulderystelser irritation op til aggression, host diarré, selv mareridt om natten, ulækkert og ikke et lægemiddel, pas på, og du kan dø

i sovjetiske tider blev de udgivet

Ivan Tue, 09/27/2016 - 20:01

I sovjetiske tider udgav de interferon, som var godt behandlet og var billigt og effektivt. ingen grund til at genopfinde hjulet.

Jeg havde bivirkninger:

Xenia ons, 23-11-2016 - 23:20

Jeg havde bivirkninger: et udslæt på mit ansigt og hævelse af mine ben. brystet. Under receptionen af ​​interferon bryst steg med 1,5 størrelse.

Remission opnået

Gæst torsdag 04/04/2018 - 11:30

Remission opnået med kronisk myeloid leukæmi

Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant human interferon alfa-2b, rekombinant plasmid og stamme, der producerer til dets gennemførelse

Opfindelsen angår genteknologi, bioteknologi, medicin, farmakologi. Ny rekombinant multi-kopi plasmid DNA pSX50, der koder for syntesen af ​​human leukocyt alfa-2b af human interferon, hvis ekspression er under kontrol af lactose- og tryptophanpromotorerne og transkriptionsterminatoren. Som et resultat af transformation af celler af E. coli BL21 rekombinant DNA-plasmid pSX50 recipientstamme opnåede stamme E. coli SX50 - leukocyt producerer rekombinant humant a-2b interferon med en produktivitet på 0,9-1,0 g a-2b interferon med en 1 liter dyrkningsmedium. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant interferon-a-2b er baseret på det genererede rekombinante stamme E. coli SX50 og dens neddykkede dyrkning omfattende et næringsmedium med et lavt indhold af tryptophan ved kontinuerlig tilsætning af næringssubstrat i biosyntese, mekanisk sprængning af mikroorganismecellerne ved højt tryk, opløsning af aggregeret protein i guanidinhydrochloridkoncentreret opløsning efterfulgt af renaturering af interferon i fysiologiske bufferopløsninger tilstedeværelsen af ​​chaotropiske midler og oprenset under anvendelse af en tretrins kromatografisk oprensning på harpikser interferon typen Chelating Sepharose Fast Flow immobiliserede ioner Cu + 2, ionbytningskromatografi på CM typen ionbytterharpikser Sephsrose Fast Flow og gelfiltreringskromatografi på Superdex 75. harpikser typen metode gør det muligt at opnå et stof interferon mere end 99% renhed i henhold til elektroforese i reducerende og ikke-reducerende betingelser ved farvning af geler med sølv og mere end 98% ifølge RF HPLC og uden indhold af pyrogener (LAL-test) i mængder ah ikke mindre end 400-800 mg fra 1 liter dyrkningsmedium. 3 n. og 3 з.п f-ly, 6 ill.

Tegninger til Den Russiske Føderations patent 2242516

Den foreliggende opfindelse angår gensplejsede lægemidler fremstillet ved bioteknologi, nemlig fremgangsmåder til industriel fremstilling af rekombinant leukocyt interferon-a-2b humane medicinske formål (herefter interferon), samt at rekombinantnm producerende stammer Escherichia coli (E. coli) og plasmid-DNA kodende for syntesen af ​​interferon.

Interferoner er proteinmolekyler med en molekylvægt på fra 15.000 til 21.000 dalton, produceret og udskilt af celler som reaktion på en viral infektion eller andre patogener. Der er tre hovedgrupper af interferoner: alpha, beta og gamma. Disse grupper selv er ikke homogene og kan indeholde flere forskellige molekylære arter af interferon. Således er mere end 14 genetiske varianter af interferon alfa blevet isoleret, som er af interesse og i vid udstrækning anvendes i medicin som antivirale, antiproliferative og immunomodulerende midler.

Kendte fremgangsmåder til fremstilling af human leukocytinterferon fra humane leukocytter af humant blod induceret af vira og andre induktorer (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Den væsentligste ulempe ved disse fremgangsmåder til fremstilling af interferoner er sandsynligheden for kontaminering af slutproduktet med humane vira, såsom hepatitis B og C-vira, immunodefektvirus mv.

I øjeblikket anerkendes en mere lovende metode til fremstilling af interferon ved mikrobiologisk syntese, hvilket giver mulighed for at opnå målproduktet med et betydeligt højere udbytte fra et relativt billigt udgangsmateriale. Tilgange anvendt i dette tilfælde gør det muligt at oprette varianter af det strukturelle gen, der er optimale til bakteriel ekspression, samt regulatoriske elementer, som styrer dets udtryk.

Som de indledende mikroorganismer anvendes forskellige konstruktioner af stammerne Pichia pastoris, Pseudomonas putida og Escherichia coli.

Ulempen ved at bruge P. pastoris som den producerende interferon (JN Garcia, JA Aguiar et. Al. // Højniveau ekspression af human IFN-2b i Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995), er de yderst vanskelige betingelser for fermentering af denne type gær, behovet for strengt at opretholde koncentrationen af ​​inducereren, især methanol, i biosynteseprocessen. Ulempen ved at bruge Ps stammer. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) er fermenteringsprocessens kompleksitet med et lavt ekspressionsniveau (10 mg interferon pr. liter dyrkningsmedium). Mere produktiv er anvendelsen af ​​Escherichia coli-stammer (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Sammen med egenskaberne for de anvendte stammer afhænger procesens effektivitet i vid udstrækning af den teknologi, der anvendes til isolering og rensning af interferon.

En fremgangsmåde til opnåelse af interferon, som omfatter dyrkning af Ps-celler. putida, ødelæggelse biomasse polyethyleniminbehandling, fraktionering med ammoniumsulfat, hydrofob kromatografi fenilsilohrome C-80, pH fraktionering lysat, dens koncentration og diafiltrering, ionbytterchromatografi på cellulose DE-52, eluering med en gradient af pH, ionbytterkromatografi resulterende elueringsmiddel cellulose-CM -52, koncentration ved passage gennem en patronfilter, og gelfiltrering på Sephadex G-100 (SU 1.640.996). En ulempe ved denne fremgangsmåde, foruden en kompleks flertrins flertrins fermentering er fremstillingen af ​​slutproduktet.

Den mest tæt analog (prototype) kan nævnes en fremgangsmåde til fremstilling af human leukocyt-interferon omfatter dyrkning af rekombinante stamme af E. coli, den resulterende biomasse frysning ved en temperatur på ikke over -70 ° C, optøning, ødelæggelse af mikroorganismecellerne med lysozym, fjernelse RNA og DNA ved at indføre lysat i DNA-ase og oprensning af det valgte uopløselig form interferon ved vask med en pufferopløsning med en detergent, opløse interferon bundfaldet i guanidinhydrochlorid opløsning og ettrins renaturering Oprensning ved ionbytningskromatografi. Som en producent anvendes en stamme af E. coli SS5 opnået ved anvendelse af rekombinant plasmid pSS5 indeholdende tre promotorer: Plac, Pt7 og Ptrp, og alpha-interferon-genet med indførte nukleotidsubstitutioner.

Interferonekspression af E. coli stammen SS5 indeholdende dette plasmid styres af tre promotorer: Plac, Pt7 og Ptrp. Ekspressionsniveauet for interferon er ca. 800 mg pr. 1 liter cellesuspension (RU 2165455).

Ulempen ved denne fremgangsmåde er den lave fremstillbarhed af brugen af ​​enzymatisk ødelæggelse af celler, DNA og RNA fra mikroorganismen og en-trins kromatografisk oprensning af interferon. Dette medfører ustabilitet i processen med isolering af interferon, fører til et fald i dets kvalitet og begrænser muligheden for at anvende ovenstående skema til industriel produktion af interferon. Ulemperne ved dette plasmid og stammen baseret på det er brugen af ​​en stærk ureguleret promotor af T7-fag i stammen E. coli BL21 (DE3) i plasmidet, hvori T7-RNA-polymerasegenet er under lac-operonpromotoren, og som altid "strømmer". Følgelig forekommer interferonsyntese kontinuerligt i cellen, hvilket fører til plasmiddissociation og et fald i stamcellernes levedygtighed og som et resultat et fald i interferonudbyttet.

Formålet med opfindelsen er at udforme en industriel rekombinanter, der producerer E. coli stamme ved anvendelse af nye rekombinante plasmid DNA med høje niveauer af interferon-biosyntese, og udvikling af en effektiv industriel teknologi til medicinske formål interferon stof tilsvarende kvalitet "European Pharmacopoeia" stof for interferon alfa-2b.

Dette problem blev løst ved oprettelsen af ​​rekombinant plasmid pSX50 DNA og Escherichia coli SX50 stamme, deponeret i den all-russiske samling af industrielle stammer af Federal State Unitary Enterprise GosNII Genetics, nummer VKPM B-8550,

og en fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant interferon-a-2b, baseret på anvendelsen af ​​en rekombinant stamme E. coli SX50 og sørge for den undersøiske dyrkning i et næringsmedium med et lavt indhold af tryptophan ved kontinuerlig tilsætning af næringssubstrat i biosyntese, mekanisk sprængning af mikroorganismecellerne ved højt tryk, opløsning af aggregeret protein i koncentreret guanidinhydrochloridopløsning efterfulgt af renaturering af interferon i fysiologisk bufferopløsning x i nærvær af chaotropiske midler og tre-trins kromatografisk oprensning af interferon harpikser Chelating Sepharose Fast Flow, immobiliseret Cu + 2-ioner, ved ionbytningskromatografi på ionbytterharpikser af typen CM Sepharose Fast Flow og gelfiltreringskromatografi på Superdex 75 harpikser type.

Opfindelsen tilvejebringer en ny rekombinant DNA multikopiplasmid pSX50, der koder en leukocyt syntese af humant a-2b interferon, hvis ekspression er under kontrol af tryptophan og lactose promotorer og transkriptionsterminatoren. Plasmid pSX50 har 3218 basepar (bp) og er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​de følgende fragmenter:

- Sekvensen fra 1 nukleotid til 176 nukleotider (n.) Inkluderer et 176 bp DNA-fragment indeholdende en tryptophanpromotor (Ptrp);

- Sekvens fra 177 n. indtil 194 n. indbefatter et syntetisk DNA-fragment på 18 p. O, der indeholder sekvensen Shine Delgarno, der er ansvarlig for initieringen af ​​translation;

- Sekvens fra 195 n. 695 n. indeholder et DNA-fragment på 501 p.O. indeholdende interferon-gensekvensen med følgende nukleotidsubstitutioner: i position 37 erstattes A med C, ved position 39 erstatter G med T, ved position 40 erstatter A med C, ved position 42 erstatter G med T i position 67 erstatter A med C ved position 69, der erstatter G med T, ved position 70 erstatter A med C ved position 72, der erstatter A med T, ved position 96, der erstatter G med A ved position 100, der erstatter A med C ved position 102 erstatter A med T ved position 114, der erstatter A med C, ved position 120, der erstatter C med G, ved position 126, der erstatter G med A, ved position 129 erstatter G med A med 330 G til C substitution i position 339 substitution G til A substitution på position 342 G til A substitution på position 487 A til C, i position 489 A til T substitution i position 495 substitution G til A;

- Sekvens fra 696 n. 713 hver indbefatter et syntetisk DNA-fragment på 18 p.O., der indeholder syntetisk polylinker;

- Sekvens fra 714 n. 1138 n. omfatter DNA fragmentet af plasmid pKK223-3 med 4129 n. 4553 n hver 425 bp i størrelse, der indeholder sekvensen af ​​den strenge transkriptionsterminator rrnBT1T2 ;

- Sekvensen med 1139 N. 1229 n. indbefatter DNA fragmentet af plasmidet pUC19 med 2487 N. i 2577 f.Kr. 91 bp i størrelse, der indeholder promotoren af ​​β-lactomase genet (ampicillinresistensgen - Amr R);

- Sekvensen fra 1230 n. 2045 n. indbefatter DNA fragmentet af plasmidet pUC4K med 720 n. 1535 n. 816 bp i størrelse, der indeholder det strukturelle område af kan-genet;

- Sekvens fra 2046 n. på 3218 n. omfatter DNA fragmentet af plasmid pUC19 fra 1625 til 453 n. 1173 bp i størrelse indeholdende sekvensen der er ansvarlig for replikationen af ​​plasmidet (ori) og lac-promotoren (Plac ).

Figur 1-5 viser designskemaet og det fysiske kort over plasmidet pSX50.

Figur 6 viser den fuldstændige nukleotidsekvens etableret for plasmid pSX50.

Escherichia coli SX50 stamme blev opnået ved at transformere Escherichia coli BL21 celler med pSX50 plasmidet ved anvendelse af traditionel genteknologi teknologi. Stammen E.Coli SX50 er kendetegnet ved følgende egenskaber.

Celler er små, lige, fortykkede stangformede, gram-negative, risperadon. Celler vokser godt på simple næringsmedier. Med vækst på agar "Difco" dannet runde, glatte, konvekse, uklare, skinnende, grå kolonier, med glatte kanter. Med vækst i flydende medier (i minimalt medium med glucose eller i LB-bouillon) danner de en intens jævn dregs.

Aerobic. Vækst temperaturområde 4-42 ° С med optimal pH 6,5-7,5.

Som nitrogenkilde anvendes både mineralsalte i ammonium- og nitratformer og organiske forbindelser i form af aminosyrer, pepton, trypton, gærekstrakt osv.

Aminosyrer, glycerin, kulhydrater anvendes som carbonkilde. Antibiotikaresistens. Celler er resistente over for kanamycin (op til 100 μg / ml).

Stammen af ​​Escherichia coli 8Х50-producerende interferon.

Metode, betingelser og sammensætning af stammeopbevaringsmedium

I L-arape med tilsætning af kanamycin til en koncentration på 20 μg / ml under olie, i L-bouillon indeholdende 15% glycerol og passende antibiotika i ampuller ved minus 70 ° C i lyofiliseret tilstand i ampuller ved + 4 ° C.

Stammen af ​​Escherichia coli SX50 er identificeret af Identifier Bergi (1974) som en stamme af arten Escherichia coli.

Fremgangsmåde til industriel produktion af alfa-2b interferon

Et træk ved den foreslåede metode er udviklingen af ​​teknologi, som gør det muligt at isolere interferon fra den uopløselige form, som akkumuleres under fermentering, hvilket gør det muligt at forenkle isolationsprocessens teknologiske plan og øge udbyttet af målproduktet betydeligt.

Fremgangsmåden består i at dyrke Escherichia coli SHS50 stamme i et næringsmedium med konstant tilsætning af næringsstofsubstrater, fortrinsvis glucose og gærekstrakt, ved biosyntese, fortrinsvis med reduceret tryptophanindhold, mekanisk destruktion af mikroorganismeceller ved højt tryk 700-900 bar, opløsning af interferon i buffer opløsning af guanidinhydrochlorid, renaturering af interferon i fysiologiske bufferopløsninger i nærværelse af kaotrope midler efterfulgt af en tretrins chromatografisk Interferon oprensning på chelaterende Sepharose hurtigstrømsharpikser immobiliseret med Cu +2 ioner, ionbytningskromatografi på CM ionbytterharpikser af CM Sepharose Fast Flow-type og gelfiltreringskromatografi på Superdex 75-harpikser.

De optimale betingelser for de individuelle stadier for opnåelse af interferon er følgende:

- fermentering udføres ved kontinuerlig tilsætning af substrater under hele processen, hvilket forårsager et højt ekspressionsniveau for interferon;

- celle ødelæggelse udføres i en Gaulin type desintegrator ved et tryk på 900 bar;

- fjernelse af opløselige cellulære komponenter (DNA, RNA, proteiner, lipopolysaccharider osv.) udføres ved at vaske den uopløselige form af interferon med pufferopløsninger indeholdende detergenter (Triton XI00, urea, etc.);

- bundfaldet indeholdende interferon opløses i en bufferopløsning af 6 M guanidinhydrochlorid;

- interferon-renaturering udføres i en fysiologisk bufferopløsning indeholdende kaotrope midler;

- tretrins kromatografisk oprensning af interferon udføres på chelaterende Sepharose Fast Flow, immobiliseret med Cu + 2 ioner, på CM Sepharose Fast Flow kationbytterharpiks og gelfiltreringskromatografi på Superdex 75-type harpiks;

- efter hver kromatografisk oprensning udføres steriliseringsfiltrering gennem pyrogenfrie filtre med en porestørrelse på 0,22 μm.

Udgangen af ​​interferon ved anvendelsen af ​​den beskrevne fremgangsmåde er ca. 400-800 mg interferon med 1 1 dyrkningsmedium. Kvaliteten af ​​det opnåede produkt opfylder normerne og kravene i "European Pharmacopoeia" for stoffet alpha-2b interferon.

Væsentlige forskelle i den foreslåede metode fra prototypen er:

- anvendelsen af ​​stamme-design med højere produktivitet, hvilket gør det muligt at opnå under biosyntese en større mængde interferon fra 1 liter dyrkningsmedium;

- anvendelse af effektiv mekanisk ødelæggelse af cellulær biomasse, hvilket gør det muligt at opnå et mere rent ekstrakt af den uopløselige form af interferon i kortere tid med mindre tab;

- brugen af ​​fysiologiske bufferopløsninger i tilfælde af renaturering i nærværelse af kaotrope midler tillader forøgelse af udbyttet af en korrekt omdannet form af interferon;

- en tre-trins kromatografisk oprensning af interferon gør det muligt at opnå et interferonstof med mere end 99% renhed ifølge elektroforese i reducerende og ikke-reducerende betingelser ved farvning af geler med sølv og mere end 98% ifølge RF HPLC-data og praktisk talt fri for pyrogener (LAL-test).

Naturen og fordelene ved den påståede gruppe af opfindelser er illustreret ved de følgende eksempler.

Eksempel 1. Konstruktion af rekombinante plasmider pS50

Fremgangsmåden til konstruktion af plasmidet pSX50 omfatter følgende trin:

- konstruktion af vektorplasmidet pSX10;

1. konstruktion af plasmid pSX3 (2641 bp)

2. konstruktion af vektorplasmidet pSX10 (2553 bp)

- konstruktion af rekombinant plasmid pSX41 (3218 bp);

- konstruktion af rekombinant plasmid pSX43 (3218 bp);

- konstruktion af rekombinant plasmid pSX45 (3218 bp);

- konstruktion af rekombinant plasmid pSX50 (3218 bp).

Konstruktion af vektorplasmid pSX10

PSX10-vektorplasmidet er en pUC19-vektor, hvori den kodende sekvens af beta lactomase genet, der tilvejebringer ampicillinresistens, erstattes af den kodende sekvens af kan-genet og indeholder en transkriptionsterminator fra plasmid pKK223-3.

Konstruktion af vektorplasmidet pSS10 udføres i to trin:

- opnåelse af plasmidet pSX3 (2641 bp), hvilket er et plasmid pUC19, hvori den kodende region af amp-genet er erstattet med det kodende område af kan-genet;

- Fremstilling af pSX10-veterinærplasmidet (2553 bp), hvilket er pSX3-plasmidet, hvori et DNA-fragment, der koder for gtBT-transkriptionsterminatoren, indsættes bag BamHI-stedet 1T2.

For at opnå plasmider pSX3 tilbringer fem runder af DNA-amplifikation ved PCR (polymerasekædereaktion). Under den første runde blev amplifikation af DNA-fragmentet på 1828 bp udført ved anvendelse af DNA'et af plasmid pUC19 som en skabelon. (fragment PU1-PU2) ved anvendelse af primere:

Denne og efterfølgende PCR-reaktioner udføres under de følgende betingelser: 20 mM Tis-HCI, pH 8,8, 10 mM (NH4)2 SO4,10 mM KCI, 2 mM MgCl2, 0,1% Triton X100.0,1 mg / ml BSA, 0,2 mM hver dNTP, 1,25 enheder. Pfu DNA-polymerase, 100 ng DNA. Amplificeringsprocessen består af følgende trin: opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter, 35 cykler af PCR (30 sekunder 95 ° C, 30 sekunder 56 ° C, 2 minutter 72 ° C) og inkubering i 10 minutter ved 72 ° C. Efter amplifikation (og efter efterfølgende amplifikationer) renses DNA-fragmentet ved elektroforese i en 1% agarosegel. Under den anden og tredje runde udføres amplifikation af et DNA-fragment på 555 bp ved anvendelse af DNA'et af plasmidet pUC4K som en skabelon. (fragment KM1-KM2) ved anvendelse af primere:

og amplifikation af DNA-fragmentstørrelsen 258 p. (KMZ-KM4) med primere

Derefter kombineres fragmenterne (KM1-KM2) og (KM3-KM4) i den fjerde amplifikationsrunde under anvendelse af primerne KM1 og KM4 for at opnå et DNA-fragment på 813 bp i størrelse. (KM1-KM4) kodende for den strukturelle del af kan-genet.

I den femte runde PCR kombineres fragmenterne (PU1-PU2) og (KM1-KM4) under de følgende betingelser: opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter, 5 cykler af PCR (30 sekunder 95 ° C, 30 sekunder 56 ° C, 10 minutter 72 ° C) og inkubering i 10 minutter ved 72 ° C. DNA'et opnået efter den sidste PCR transformeres direkte til celler i E. coli DH5-stammen og pletteres på LA-medium indeholdende 20 μg / ml kanamycin. Efter inkubering i 12 timer ved 37 ° C screenes klonerne, plasmid-DNA isoleres, og restriktionsanalyse udføres. Resultatet er plasmid S3 størrelse 2641 p.

For at opnå vektorplasmidet pSX10 tilbringer tre runder DNA-amplifikation ved PCR. Under den første runde udføres amplifikation af DNA-fragmentet med størrelsen 2025 bp ved anvendelse af DNA'et af plasmid pSX3 som en skabelon. (fragment 10.1-10.2) under anvendelse af primere:

I løbet af anden runde udføres amplifikation af DNA-fragmentet med størrelsen 528 bp ved anvendelse af DNA fra plasmid pKK223-3 som en skabelon. (fragment KK1-KK2) ved anvendelse af primere:

I den tredje runde PCR kombineres fragmenterne (10.1-10.2) og (CK1-CK2) under de følgende betingelser: opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter, 5 cykler af PCR (30 sekunder 95 ° C, 30 sekunder 56 ° C, 10 min 72 ° C C) og inkubering i 10 minutter ved 72 ° C. DNA'et opnået efter den sidste PCR transformeres direkte til celler i E. coli DH5-stammen og pletteres på LA-medium indeholdende 20 μg / ml kanamycin. Efter inkubering i 12 timer ved 37 ° C screenes klonerne, plasmid-DNA isoleres, og restriktionsanalyse udføres. Resultatet er plasmid pSX10 størrelse 2553 p.

Konstruktion af rekombinant plasmid pSX41

- Det rekombinante plasmid pSX41 er et Hind III-BamHI DNA-fragment af vektorplasmidet pSX3 (2529 bp), Hind III er et EcoRI 168 bp DNA fragment kodende for E. coli tryptophan operonpromotoren (Ptrp), EcoRI-XbaI syntetisk DNA fragmentstørrelse på 20 p. O., der koder for SD-sekvensen (Shine-Dalgarno) og XbaI-BamHI DNA-fragmentet på 501 p.O., der koder for det humane alfa 2b alfa 2b-gen.

For at opnå Hind III-BamHI DNA-fragmentet af vektorplasmidet pSX3 (2529 bp) fordøjes plasmid pSX3 DNA med HindIII og BamHI restriktionsenzymer efterfulgt af elektroforetisk oprensning i 1% agarosegel. Hind III EcoRI 168 bp DNA fragment kodende for promotoren af ​​tryptophanoperonen (Ptrp) opnået ved PCR under anvendelse af totalt E. coli DNA som en skabelon og primere TRP1 og PRP2 efterfulgt af behandling af det amplificerede fragment med restriktionsenzymer HindIII og EcoRI:

For at opnå det EcoRI-Xbal syntetiske DNA-fragment på 20 bp, der koder for SD-sekvensen (Shine-Dalgarno), syntetiseres følgende komplementære oligonukleotider:

Et XbaI-BmIII-DNA-fragment på 501 bp, der koder for alfa 2b-genet af human interferon, opnås ved PCR under anvendelse af totalt humant DNA som en skabelon og primere IFN1 og IFN2 efterfulgt af behandling af det amplificerede fragment med Xbal og BamIII-restaseraser:

Derefter kombineres de elektroforetiske rensede fragmenter, ligeres med enzym-ligasen af ​​fag T4, DNA'et transformeres til celler i E. coli DH5-stammen og belægges på LA-medium indeholdende 20 μg / ml kanamycin. Efter inkubering i 12 timer ved 37 ° C screenes klonerne, plasmid-DNA isoleres, restriktionsanalyse udføres, og DNA'ets primære struktur bestemmes. Resultatet er plasmid pSX41 størrelse 3218 p. Udfør derefter en faset mutagenese af interferon-genet for at forøge målproduktets ekspressionsniveau. Mutagenesen af ​​interferongenet består i at erstatte tripletter, som sjældent findes i E. coli, der koder for de tilsvarende aminosyrer med tripletter, der ofte findes i E. coli, der koder for de samme aminosyrer. Mutagenesen af ​​DNA'et af interferon-genet udføres ved PCR.

Konstruktion af rekombinant plasmid pSX43

For at opnå rekombinant plasmid pSX43 udføres en runde DNA-amplifikation ved PCR under anvendelse af plasmid-DNA'et pSX41 som en template og primere IFN3 og IFN4:

PCR udføres under følgende betingelser: opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter, 20 cykler af PCR (30 sekunder 95 ° C, 30 sekunder 56 ° C, 10 minutter 72 ° C) og inkubering i 20 minutter ved 72 ° C. DNA'et opnået efter PCR transformeres direkte til celler i E. coli DH5-stammen og belades på LA-medium indeholdende 20 μg / ml kanamycin. Efter inkubering i 12 timer ved 37 ° C screenes klonerne, plasmid-DNA isoleres, restriktionsanalyse udføres, og DNA'ets primære struktur bestemmes. Resultatet er plasmid S43 størrelse 3218 p.

Konstruktion af rekombinant plasmid pSX45

For at opnå rekombinant plasmid pSX45 udføres en runde DNA-amplifikation ved PCR under anvendelse af plasmid-DNA pSX43 som en skabelon og primere IFN5 og IFN6:

PCR udføres under følgende betingelser: opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter, 20 cykler af PCR (30 sekunder 95 ° C, 30 sekunder 56 ° C, 10 minutter 72 ° C) og inkubering i 20 minutter ved 72 ° C. DNA'et opnået efter PCR transformeres direkte til celler i E. coli DH5-stammen og belades på LA-medium indeholdende 20 μg / ml kanamycin. Efter inkubering i 12 timer ved 37 ° C screenes klonerne, plasmid-DNA isoleres, restriktionsanalyse udføres, og DNA'ets primære struktur bestemmes. Resultatet er plasmid pSX45 størrelse 3218 p.

Konstruktion af rekombinant plasmid pSX50.

For at opnå rekombinant plasmid pSX50 udføres en runde DNA-amplifikation ved PCR under anvendelse af plasmid-DNA'et pSX45 som en skabelon og primere IFN7 og IFN8:

PCR udføres under følgende betingelser: opvarmning ved 95 ° C i 5 minutter, 20 cykler af PCR (30 sekunder 95 ° C, 30 sekunder 56 ° C, 10 minutter 72 ° C) og inkubering i 20 minutter ved 72 ° C. DNA'et opnået efter PCR transformeres direkte til celler i E. coli DH5-stammen og belades på LA-medium indeholdende 20 μg / ml kanamycin. Efter inkubering i 12 timer ved 37 ° C screenes klonerne, plasmid-DNA isoleres, restriktionsanalyse udføres, og DNA'ets primære struktur bestemmes. Resultatet er plasmid pSX50 størrelse 3218 p.

Eksempel 2. Fremskaffelse af en stamme af E. coli SX50 - producent af interferon

Den stammeproducerende interferon E. coli SX50 opnås ved at transformere celler fra stammen E. coli BL21 med det rekombinante plasmid pSX50. Den spændingsfrembringende interferon dyrkes i en 30 l fermentor til en optisk densitet på 25,0-30,0 pu i M9-medium indeholdende 1% kaseinsyrehydrolysat (Difco), 1% glucose, 40 μg / ml kanamycin ved en temperatur på 38-39 ° C. I fermenteringsprocessen udføres den kontinuerlige tilsætning af næringsstoffet under anvendelse af en gravitometrisk regulator.

Indholdet af interferon i biomassen af ​​celler opnået fra 1 liter kultur afhængigt af serien er 0,9-1,0 g interferon.

Eksempel 3. Fremgangsmåde til isolering af interferon fra E. coli SX50 stamme

Indhentning af interferon blev udført i 4 trin:

Trin 1 Dyrkning af E. coli SX50.

Trin 2 Isolering og rensning af den uopløselige form af interferon.

Trin 3 Opløsning og renaturering af interferon.

4 trin. Kromatografisk oprensning af interferon.

Trin 1 Dyrkning af E. coli SX50 stamme

Den dyrkede frø af E. coli SX50-stamme i et volumen på 3 liter rige LB-medium i 12 timer ved 26 ° C blev introduceret aseptisk i en fermentor indeholdende 27 liter sterilt medium indeholdende M9, 1% sur kaseinhydrolysat, 1% glucose, 1 mM MgCl22, 0,1 mM CaCl2, 40 mg / ml kanamycin. Dyrkning i fermenteren udføres ved en temperatur på 38-39 ° C, idet pH opretholdes ved 7 ± 0,15 ved automatisk subtilisering med 40% natriumhydroxidopløsning. Koncentrationen af ​​opløst oxygen i området (50 ± 10)% mætning opretholdes ved at ændre omrørers hastighed fra 100 til 800 omdrejninger pr. Minut, og luftforsyningen fra 1 til 15 l / min. Koncentrationen af ​​substrater, især glucose og gærekstrakt, måles under fermentering og opretholder deres koncentration ved at ændre foderhastigheden af ​​de koncentrerede opløsninger gennem peristaltiske pumper ved anvendelse af en gravimetrisk regulator.

Akkumuleringen af ​​interferon i form af en uopløselig form styres ved fase-kontrastmikroskopi ved elektroforese på en 15% polyacrylamidgel (SDS-PAAG) og ved omvendt fase højtydende kromatografi (RF HPLC). Fermentering stoppes, når den maksimale optiske tæthed er nået (

25-30 PU. Og stop syntese af interferon. Ved afslutningen af ​​fermenteringen separeres kulturfluidet ved centrifugering i en gennemstrømningsrotor ved en omdrejningstal på 5000-10000 rpm. Biomasse pakkes i plastikposer og fryses ved minus 70 ° C.

Trin 2 Isolering og rensning af den uopløselige form af interferon

300-400 g frossen biomasse af E. coli SX50 stamme suspenderes i 3000 ml buffer 1 (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspensionen ledes gennem en flowhomogenisator af Gaulin-typen, et tryk på 900 bar opretholdes og centrifugeres i en gennemstrømningsrotor ved 15.000 omdr./min. Bundfaldet vaskes under lignende betingelser successivt med buffere 2 (20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M urea) og buffer 3 (20 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA) og til sidst suspenderes interferonfældningen i 200 ml buffer. Samtidig er tiden for isolering og rensning af den uopløselige form af interferon ikke mere end 5 timer.

Trin 3 Opløsning og renaturering af interferon

Til suspensionen af ​​den uopløselige interferonform opnået i det foregående trin tilsættes tør guanidinhydrochlorid til en koncentration på 6 M, tilsættes ditithreitol til en koncentration på 50 mM, Tris-HCI pH 8,0 til en koncentration på 50 mM NaCl til en koncentration på 150 mM og Triton X100 til en koncentration på 0,1%, inkuberes ved ved stuetemperatur i 2 timer. Det uopløste materiale separeres ved sterilisering af filtrering gennem membraner med porediametre på 0,22 mikrometer.

Interferon-renaturering udføres ved langsomt fortynding af den resulterende opløsning 100-200 gange med buffer 4 (20 mM Tris-HCI pH 8,0, 100 mM NaCI, 0,1 mM EDTA). Derefter inkuberes renatureringsblandingen med konstant omrøring i 12-15 timer ved en temperatur på 4-8 ° C. Derefter tilsættes magnesiumsulfat til en koncentration på 1 mM, og det aggregerede materiale fjernes ved sterilisering af filtrering gennem et membranfilter med en porediameter på 0,22 mikron.

4 trin. Kromatografisk oprensning af interferon

Kromatografisk oprensning af interferon udføres i tre trin.

1. Det resulterende renaturerede interferon renses først ved affinitetskromatografi på en chelaterende Sepharose Fast Flow resin (Amersham Biosciences) immobiliseret med Cu +2 ioner. For at gøre dette påføres interferonopløsningen på en søjle med Cu +2-chelaterende Sepharose Fast Flow, og interferonet elueres med 0,1 M citronsyrepuffer pH 2,2.

2. I den anden fase af kromatografisk oprensning påføres interferonopløsningen på en CM Sepharose Fast Flow kationbytterharpiks (Amersham Biosciences), og interferonen elueres med en opløsning af opløsninger (0,0-0,5 M NaCl) i en buffer af 50 mM Na (CH3COO) pH 5,5.

3. Rensning af den monomere form af interferon fra rester af de polymere former af interferon udføres i tredje trin af oprensning af interferon ved gelfiltrering på en Superdex 75-type harpiks (Amersham Biosciences). Kromatografi udføres i en buffer på 50 mm Na (CH3COO), pH 5,0, indeholdende 0,15 M NaCl.

Den beskrevne fremgangsmåde til isolering og oprensning af interferon gør det muligt at opnå 4-8 g højrenset interferon i en isolationscyklus i 7-10 dage fra biomasse opnået fra 10 1 dyrkningsmedium. Kvaliteten af ​​det opnåede interferon opfylder fuldt ud kravene i "European Pharmacopoeia" for stoffet interferon alfa-2b, nemlig:

- Interferonkoncentration på mindst 2 × 10 8 IE / ml;

- Den specifikke aktivitet af interferon er ikke mindre end 2,0 x 10 8 IE / mg;

- Den elektroforetiske renhed af lægemidlet er ikke mindre end 99% i reducerende og ikke-reducerende betingelser, når farvning af geler med sølv;

- Indholdet af den korrekt renaturerede form af interferon er mindst 98% ifølge HPLC RF data;

- Det isoelektriske punkt af det isolerede interferon er i området pH 5,8-6,3;

- Peptidkortet for det isolerede interferon er ikke fundamentalt forskelligt fra peptidkortet for den europæiske standard interferon alfa-2b CRS;

- Indholdet af bakterielle endotoksiner er ikke mere end 100 ME per 1 mg interferon.

Som det fremgår af ovenstående eksempler tillader den påståede gruppe opfindelser at opnå interferon alfa-2b med høj output med en forholdsvis enkel og pålidelig teknologi.

Formel ifølge opfindelsen

1. Rekombinant plasmid DNA pSX50 kodende for syntesen af ​​rekombinant human alfa-2b interferon, kendetegnet ved at den har en størrelse på 3218 basepar (bp) og består af følgende fragmenter: sekvensen fra 1 til 176 nukleotider (n.) Inkluderer et fragment 176 bp DNA indeholdende tryptophanpromotoren (Ptrp), sekvensen fra 177 til 194 n. indbefatter et syntetisk DNA-fragment på 18 p.O., der indeholder sekvensen Shine Delgarno, der er ansvarlig for initieringen af ​​translation, sekvensen fra 195 til 695 N. indeholder et DNA-fragment på 501 p.O. indeholdende interferon alfa-2b genet med nukleotidsubstitutioner: 37 (A> C), 39 (G> T), 40 (A> C), 42 (G> T), 67 A> C), 69 (G> T), 70 (A> C), 72 (A> T), 96 (G> A), 100 (A> C), 102 (A> T), 114 (A > C), 120 (C> G), 126 (G> A), 129 (G> A), 330 (C> G), 339 (G> A), 342 (G> A), 487 C), 489 (A> T), 495 (G> A), sekvensen fra 696 til 713 n. indbefatter et syntetisk DNA-fragment på 18 p. O. indeholdende en syntetisk polylinker, sekvensen fra 714 til 1138 N. indbefatter DNA fragmentet af plasmidet pKK223-3 fra 4129 til 4553 n. 425 bp i størrelse, der indeholder sekvensen af ​​den strenge transkriptionsterminator rrnBT1T2, sekvensen fra 1139 til 1229 N. omfatter DNA fragmentet af plasmid pUC19 fra 2487 til 2577 N. størrelsen på 91 p. O., der indeholder promotoren af ​​genlaktomasen (genet for resistens mod ampicillin-Amp R), sekvensen fra 1230 til 2045 N. indbefatter DNA fragmentet af plasmidet pUC4K med 720 n. 1535 n. 816 bp i størrelse, der indeholder det strukturelle område af kan-genet, sekvens fra 2046 n. på 3218 n. omfatter DNA fragmentet af plasmid pUC19 fra 1625 til 453 n. 1173 bp i størrelse indeholdende sekvensen der er ansvarlig for replikationen af ​​plasmidet (ori) og lac-promotoren (Plac).

2. Stammen af ​​bakterier Eschcerichia coli SX50 transformeret med det rekombinante plasmid ifølge krav 1 - producerende rekombinant human leukocytinterferon alfa-2b.

3. Fremgangsmåden til fremstilling af human interferon alfa-2b, herunder dyrkning af Escherichia coli SX5-stamme ifølge krav 2 i et næringsmedium med den konstante tilsætning af næringssubstrater under biosyntese, mekanisk destruktion af mikroorganismerceller ved et tryk på 700-900 bar, opløsning af interferon i guanidinhydrochloridpufferopløsning, renaturering af interferon i fysiologiske bufferopløsninger i nærvær af kaotrope midler, tretrinskromatografisk oprensning af interferon på chelaterende Sepharose-fastflydende harpikser immobiliseret med Cu +2-ioner, ionbytningskromatografi på ionbytterharpikser, såsom CM Sepharose Fast Flow og gelfiltreringskromatografi på harpikser, såsom Superdex 75.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor dyrkningen udføres på et næringsmedium med et lavt indhold af tryptophan med kontinuerlig tilsætning af næringssubstrater, fortrinsvis glucose og gærekstrakt.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvori den inden oprensning af interferon renses ved at fjerne opløselige cellulære komponenter, herunder DNA, RNA, proteiner, lipopolysaccharider, vask med pufferopløsninger indeholdende detergenter som Triton XI 00, urinstof.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvori der efter hver kromatografisk oprensning udføres steriliserende filtrering gennem filtre med en porestørrelse på 0,22 μm.